Nieuwe genediteertechniek plakt grote DNA-stukken precies in het genoom

Genetische ziekten ontstaan vaak door fouten die zich over een groot stuk DNA uitstrekken, soms duizenden basenparen lang. Het herstellen van zulke fouten is lastig, omdat bestaande gentherapieën vooral geschikt zijn voor kleine mutaties. Onderzoekers publiceerden nu in Nature Biotechnology een nieuwe methode die grote DNA-fragmenten precies op de juiste plek in het genoom kan invoegen, zonder dat daarbij een dubbelstrengsbreuk ontstaat.

Plakken als bij Gibson-assemblage

De techniek heet prime assembly (PA) en bouwt voort op prime editing, een methode waarbij DNA wordt herschreven zonder het volledig door te knippen. PA gebruikt speciale gidsmoleculen, pegRNA's genaamd, om zowel op de doellocatie in het genoom als op een stuk donor-DNA een los, enkelstrengs DNA-uiteinde te maken. Deze twee uiteindes zijn complementair aan elkaar en vinden elkaar vanzelf, ongeveer zoals bij Gibson-assemblage, een techniek waarmee DNA-stukjes in het laboratorium aan elkaar worden geplakt. Na deze hechting kopieert de cel het donor-DNA in het genoom in.

De onderzoekers testten drie varianten van de methode. Bij de eenvoudigste versie wordt één plakverbinding gemaakt; bij een tweede variant wordt daarnaast een extra insnijding aangebracht om het proces te versnellen. De derde en krachtigste variant gebruikt twee plakverbindingen tegelijk, waardoor een stuk genoom kan worden verwijderd en in één beweging vervangen door nieuw DNA.

Tot 58 procent efficiëntie, ook in T-cellen

In proeven met menselijke HEK293T-cellen slaagden de onderzoekers erin om een bestaande DNA-sequentie te vervangen door een donorfragment van 2,9 duizend baseparen, met een efficiëntie tot 57,8 procent. Meer dan 90 procent van de ingevoegde fragmenten bleek foutloos op de juiste plek te zitten. De donor-DNA's die de methode aankan variëren van 1.000 tot 6.500 baseparen, en kunnen zowel plasmiden als losse, lineaire DNA-stukken zijn.

Belangrijker voor toekomstige toepassingen is dat PA ook werkte in primaire menselijke T-cellen, de afweercellen die de basis vormen van CAR-T-therapie tegen kanker. Daar wisten de onderzoekers met een efficiëntie tot 28,1 procent een gen voor een chimere antigeenreceptor op een vaste plek in het genoom te zetten. In een proef met levende muizen, waarbij een GFP-gen via hydrodynamische injectie in de lever werd gebracht, integreerde het donor-DNA gemiddeld in 4,3 procent van de GFP-positieve levercellen.

Voordeel ten opzichte van bestaande methoden

Veel bestaande technieken voor grote DNA-inserties, zoals homologie-gerichte reparatie, zijn afhankelijk van een dubbelstrengsbreuk in het DNA. Zulke breuken kunnen ongewenste neveneffecten hebben: extra mutaties op de plek zelf, verlies van grote stukken DNA, chromosoomafwijkingen of zelfs celdood. Omdat prime assembly geen dubbelstrengsbreuk nodig heeft, ontwijkt de methode dat risico. Dat maakt de techniek volgens de onderzoekers kansrijk voor toekomstige gentherapieën waarbij grote, foutieve stukken DNA moeten worden vervangen door een gezonde versie.