RNA-CRISPR lijkt effectiever dan het is door meetfout in populaire test

Onderzoekers ontdekten dat een veelgebruikte laboratoriumtest structureel te positieve resultaten geeft bij het meten van RNA-afbraak door CRISPR-systemen. Het probleem zit in de gids-RNA's zelf: die blijven na extractie in het monster achter en verstoren de meting, waardoor het lijkt of een gen sterker is uitgeschakeld dan in werkelijkheid het geval is.

Een storende ontdekking

Het team onderzocht CRISPR-systemen die niet het DNA maar het RNA van een cel aanpakken. Dat is nuttig omdat RNA-knockdown, in tegenstelling tot het knippen van DNA, tijdelijk en omkeerbaar is. Om te meten hoeveel RNA er na behandeling nog overblijft, gebruiken laboratoria wereldwijd doorgaans RT-qPCR: een techniek die RNA eerst omzet in DNA en dat vervolgens vermenigvuldigt en telt.

Bij het testen van het Csm-systeem, een variant van CRISPR die met meerdere eiwitten tegelijk werkt, viel de onderzoekers iets vreemds op. Een mutante versie van het systeem die door een fout in het eiwit helemaal geen RNA kan knippen, liet in de test toch een duidelijke afname van RNA zien. Dat kon niet kloppen: zonder knipactiviteit hoort er niets af te breken.

Gids-RNA verstopt de meting

Verder onderzoek wees uit dat niet het CRISPR-eiwit, maar het gids-RNA de boosdoener is. Dit korte stukje RNA, dat het CRISPR-systeem naar zijn doelwit leidt, blijft na het isoleren van cellulair RNA gedeeltelijk aanwezig in het monster. Tijdens de testreactie plakt het gids-RNA aan het doel-RNA vast en blokkeert het de omzetting naar DNA. Dat gebeurt vooral wanneer de gemeten regio, het amplicon, over de plek loopt waar het gids-RNA bindt, of er vlak boven zit.

Het effect trad op bij alle geteste systemen: naast Csm ook bij de veelgebruikte Cas13-varianten Psp Cas13b en CasRx. Bij het gen XIST, dat betrokken is bij het uitschakelen van een van de twee X-chromosomen bij vrouwen, en bij het kankergen BRCA1 zagen de onderzoekers dat de gangbare testopstelling knockdownpercentages tot wel 90 procent liet zien, terwijl een preciezere meting veel lagere waarden opleverde.

Gevolgen voor het vakgebied

Omdat RT-qPCR al jaren de standaardmethode is om RNA-knockdown te bevestigen, kunnen eerder gepubliceerde resultaten over de effectiviteit van RNA-gerichte CRISPR-systemen te rooskleurig zijn geweest. De onderzoekers adviseren twee aanpassingen: gebruik een reverse transcriptase-enzym met sterke verdringingsactiviteit, dat zich niet laat tegenhouden door het vastgeplakte gids-RNA, en meet bij voorkeur een amplicon dat niet over de bindingsplaats van het gids-RNA heen loopt. Daarnaast raden ze aan de RNA-meting aan te vullen met een onafhankelijke methode, zoals het meten van de hoeveelheid eiwit die de cel nog aanmaakt.

De bevinding raakt een groeiend onderzoeksveld. RNA-gerichte CRISPR-systemen gelden als veelbelovend alternatief voor DNA-editing, juist omdat ze geen permanente veranderingen in het genoom achterlaten en dus makkelijker terug te draaien zijn. Voor toepassingen in de kliniek, waar nauwkeurigheid cruciaal is, is het essentieel dat de werkzaamheid van zulke systemen betrouwbaar wordt vastgesteld voordat ze verder worden ontwikkeld.